尊龙凯时 - 同源重组法质粒构建中的尊龙凯时关注要点

在上期中，我们探讨了同源重组法构建质粒的实验步骤。那么在实验过程中有哪些关键事项需要特别关注呢？让我们一起深入了解一下！

同源重组法质粒构建中的尊龙凯时关注要点

同源重组法质粒构建中的注意事项

尊龙凯时强调以下几个关键点：

同源臂的长度一般为15-20bp，且GC含量应在40%-60%之间。在计算引物的Tm值时，仅需考虑特异性引物部分，不包括同源臂和酶切位点。如果引物长度超过40bp，建议选用PAGE纯化方式以提高阳性克隆率。

在进行PCR扩增插入片段时，如果目的片段较难扩增，可以先使用不带同源臂的引物克隆目的片段，再用电泳回收的产物为模板，用带有同源臂的引物进行二次PCR扩增。然而，这种方法可能会引入较多突变，需谨慎使用。

使用限制性内切酶进行载体线性化时，要确保酶切反应完全，必要时可延长酶切时间或采用双酶切策略。若使用单酶切线性化载体，需注意可能残留的原生环状质粒，导致转化不准确。

在胶回收过程中使用新的刀片，防止外源DNA污染。此外，要确保胶回收产物的质量和浓度，以便后续能够准确计算使用量。

应严格按照载体与插入片段的最适摩尔比1:2来计算和使用，以提高重组效率。如果使用未经纯化的线性化克隆载体和插入片段扩增产物，其加入的总体积应不超过反应体系体积的1/5。

重组反应需要在冰上配置反应体系，使用移液器轻轻吸打混匀，避免过度振荡。通常反应温度应保持在37℃，反应时间为30分钟左右。反应时间不足或过长都可能降低克隆效率。

感受态细胞应在冰上解冻，加入重组产物后轻轻混匀以避免细胞损伤。热激的时间和温度必须准确把握，热激后需迅速置于冰上冷却。同时，转化产物的涂布量也需适中，过多或过少可能影响阳性克隆的筛选。

赴菌落PCR鉴定时，务必选择合适的引物和PCR程序，确保结果的准确性。对于初步鉴定为阳性的菌落，推荐进行测序以终确认重组质粒的正确性。

1. 若胶回收产物低，浓度不足以做连接，可考虑增加实验起始量，因为大部分胶回收试剂盒的回收率仅为30%-60%。

2. 当扩增的PCR产物无条带或条带较弱时，需检查引物的Tm值及GC比，可能需要更换引物或调整PCR条件。

3. 如果涂板后没有菌落或仅有少量菌落，可能是线性化克隆载体和插入片段的使用量不当，建议采用双酶切法切割载体，避免自连现象。

4. 菌液PCR无条带可能由于载体连接不成功或引物设计不当导致。

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