尊龙凯时 - 尊龙凯时肠道固有层免疫细胞分离制备指南

尊龙凯时提供了一种高效的实验方法，旨在分离小鼠肠道固有层免疫细胞，优化实验过程以确保获得纯净且具有代表性的细胞群体。以下是详细的实验步骤和制备方法。

尊龙凯时肠道固有层免疫细胞分离制备指南

实验前准备

首先，配制40% Percoll溶液。将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）以9:1的体积比例混合，得到等渗的100% Percoll母液。接着，将100% Percoll母液和RPMI1640/1×PBS以4:6的比例混合，制得40%等渗Percoll溶液。

同样地，制备80% Percoll溶液。将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）以9:1的体积比例混合获得100% Percoll母液，再用该母液与RPMI1640/1×PBS按8:2的比例混合，配制80%的等渗Percoll溶液。

1）通过颈椎脱臼法处死小鼠，固定在手术台上。使用75%酒精消毒小鼠腹部，在正中纵向切开，暴露腹腔；

2）在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断，同时分离小肠周围的脂肪组织和肠系膜，拉出小肠，并在小肠与盲肠的连接处剪断，以分离出小肠。去除派伊尔结以确保获得更纯净的细胞群体，从而提高实验的可靠性。

3）将小肠放入装有5mL 4°C预冷PBS的培养皿中润洗，使用镊子和剪刀去除脂肪组织和派伊尔结；

4）把小肠切成四段并纵向剪开，刮除肠内容物；

5）将小肠转移至50mL离心管中，加入10mL HBSS+2% FBS并剧烈涡旋10-20秒；

6）用镊子取出小肠并重复清洗两次。

7）将洗净的肠组织剪碎成0.5cm的小片，转入2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，37°C下轻摇孵育60分钟；

8）取出管子，剧烈涡旋并通过70μm细胞筛网过滤，洗涤细胞筛网并收集含细胞的滤液；

9）将滤液转移至50mL管中，进行离心，弃去上清液，用4mL 40% Percoll重悬细胞沉淀；

10）逐层添加25mL 80% Percoll，形成密度梯度，并注意不要破坏界面；

11）在800g条件下离心20分钟。分离结束后，收集中间的白膜层免疫细胞，并用4°C预冷PBS清洗；

12）按照先前的清洗步骤重复一次，最后得到肠道固有层淋巴细胞；

13）使用细胞染色缓冲液重悬细胞沉淀，并调整浓度至5-10×10⁶ cells/mL，分配100μL/管用于后续实验。