### 培养条件

在细胞培养过程中，建议的气相组成为95%空气与5%二氧化碳，温度应保持在37℃。传代方法方面，首次传代建议采用1:2的比例。在每次传代时，建议每两天更换培养基。

在接收细胞后，请务必及时检查培养瓶上的细胞名称是否与订单一致，确保没有破损或漏液的情况。若未发现任何异常，请在显微镜下观察细胞生长状态，并拍摄不同倍数的细胞照片（建议40x, 100x, 200x各一张）。前三天的照片是重要的售后依据，若不提供照片则默认细胞状态良好。

### 贴壁细胞传代步骤

1. 弃去培养上清，使用不含钙镁离子的PBS冲洗细胞1-2次。

2. 向培养瓶中添加约1-2ml的0.25%胰蛋白酶消化液，置于37℃培养箱中消化1-2分钟。观察细胞状态，如果细胞大部分变圆并脱落，迅速取回操作台，轻轻敲击培养瓶后加入超过5ml的完全培养基以终止消化。

3. 轻轻吹打细胞使其完全脱落后吸出，转移悬液至15ml离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清，加入1-2ml完全培养基重悬细胞。

4. 将细胞悬液以1:2的比例分瓶传代（两个T25瓶），并补充新的完全培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5%CO2的培养箱中进行培养。

### 悬浮细胞传代步骤

1. 可选择使用半换液法。将培养瓶竖直放置在培养箱中静置约1小时，轻轻吸去3ml培养基，补充3ml完全培养基。如培养基变色较慢，可直接添加约500ul的FBS。传代时也可以直接补充5ml培养基并分配到两个培养瓶中，通常经过3次传代后可进行离心传代。

2. 若要分瓶，可将细胞悬液收集至离心管中，在1000RPM下离心5分钟，弃去上清后补加1-2ml培养液重悬。将细胞悬液以1:2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基，以确保细胞的活力，后续传代可根据实际情况按1:2至1:5的比例进行。

### 细胞冻存

1. 当细胞生长至覆盖培养瓶80%面积时，弃去培养液并用PBS清洗细胞一次。

2. 向培养瓶中添加约1ml的0.25%胰蛋白酶消化液，倒置观察，待细胞回缩变圆后加入5ml完全培养基终止消化，轻轻吹打使细胞脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀细胞后加入1ml的雅吉生物无血清冻存液（货号：C7001），混匀后转入冻存管中。

4. 将冻存细胞直接放入-80℃冰箱，若需转入液氮罐，则需在-80℃冰箱中存放24小时以上后再转移。

### 细胞复苏

1. 从液氮中取出细胞冻存管（请注意佩戴防护面具），迅速将其放入37℃水浴中解冻，直至无结晶后，用75%酒精擦拭冻存管外壁。

2. 将冻存管中的细胞移至含5ml完全培养基的15ml离心管中，1000RPM离心5分钟。

3. 弃去上清，沉淀后用5ml完全培养基重悬并接种至T25培养瓶中，放在37℃、5% CO2的培养箱中进行培养。

4. 第二天，更换为新鲜的完全培养基继续培养。

### 注意事项

在运输过程中，有些细胞可能会因贴壁不牢而发生脱落，这是正常现象。若细胞脱离较多，可将所有培养液收集至离心管中，1000RPM离心5分钟，收集上清作过渡培养。沉淀后的细胞可加入1-2ml胰酶，轻轻吹打并重悬，消化1-2分钟后加入5ml完全培养基以终止反应。再离心、弃上清，添加1-2ml完全培养基重悬，按照1:2比例分瓶传代（两个T25瓶），补充新的培养基至5-8ml/瓶，最后放入37℃、5% CO2的培养箱中培养。

### 细胞问题处理与重发政策

若细胞出现问题，有以下重发情况：1. 运输过程中产生的细胞丢失、瓶身破损或严重漏液等；2. 细胞污染问题，需在收到产品48小时内提供真实实验结果；3. 常温发货或干冰实发的细胞存活率低，需提供照片；4. 细胞活性问题，需在7天内提供活力鉴定结果。

而不予重发的情况包括：1. 客户造成的污染；2. 用户操作不当或非推荐培养体系导致的细胞状态问题；3. 未提供培养前照片的细胞状态差，不予重发。

**尊龙凯时**致力于为您提供高质量的细胞培养服务，确保您的实验顺利进行。