肌动蛋白（Actin）在活细胞中显示出动态和可变的结构特性。通过个体细胞和固定细胞中的Actin染色，可以明确细胞骨架的结构与功能。在这一领域，Cytoskeleton作为细胞骨架及小G蛋白的研究专家，提供了全面的骨架蛋白染色试剂和方案。在此，尊龙凯时将为大家详细介绍固定细胞和活细胞中Actin的染色步骤。

一、固定细胞中的Actin染色步骤

在固定细胞中，肌动蛋白的结构可通过荧光鬼笔环肽（phalloidins）和肌动蛋白抗体进行观察。荧光鬼笔环肽与F-actin的天然四级结构结合，能够降低背景信号。而抗体则可识别单体与多聚体肌动蛋白（包括丝状或F-actin），因此可能会出现较高的背景信号。使用合适的固定剂以维持Actin的天然结构是十分重要的。推荐使用多聚甲醛作为固定剂，因为它能够有效保留Actin的四聚体结构，适合高亲和力的荧光鬼笔环肽结合；而冷甲醇的使用应避免，因为它会破坏Actin的天然构象。

1. 使用荧光鬼笔环肽进行Actin染色的步骤（以Acti-Stain488Phalloidin为例）

1) 将35μl的荧光鬼笔环肽储备液（14μM）稀释至500μl PBS，制作100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液，在室温下避光保存。
2) 取出含有细胞的载玻片（细胞汇合度约50%）。
3) 弃去培养基，使用PBS轻轻洗涤细胞（室温下）。
4) 将载玻片转移至湿盒中，每张载玻片上滴加200μl的固定液（含37%多聚甲醛的PBS，pH=7.0），在室温下固定10分钟。
5) 用PBS轻轻冲洗细胞30秒（室温）。
6) 每张载玻片上滴加200μl的通透剂（含0.5% Triton X-100的PBS），在湿盒中室温通透5分钟。
7) 用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30秒（室温）。
8) 滴加200μl 100nM的Acti-Stain488Phalloidin工作液，在湿盒中室温避光孵育30分钟。
9) 用PBS冲洗载玻片三次，每次30秒（室温）。
10) （可选）滴加200μl含100nM DAPI的PBS，室温染色30秒。
11) （可选）用PBS冲洗载玻片30秒（室温）。
12) 用纸巾轻轻去除载玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂。
13) 静置20分钟晾干后，用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24小时。

2. 使用肌动蛋白抗体进行Actin染色的步骤（以Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody为例）

1) 取出含有细胞的载玻片（细胞汇合度约50%）。
2) 弃去培养基，使用PBS轻轻洗涤细胞（室温下）。
3) 将载玻片转移至湿盒中，每张载玻片上滴加200μl的固定液（甲醇），在室温固定10分钟。
4) 用PBS轻轻冲洗细胞两次，每次30秒（室温）。
5) 每张载玻片上滴加200μl的通透剂（含0.5% Triton X-100的PBS），在湿盒中室温通透15分钟。
6) 用PBS轻轻冲洗两次细胞，每次30秒（室温）。
7) 每张载玻片上滴加200μl含0.1% BSA、0.3% Mglycine的PBST（PBS + 0.01% Tween），在湿盒中室温封闭1小时。
8) 每张载玻片上滴加200μl Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody（稀释比例1:250-1:500，PBS稀释），在湿盒中室温孵育90分钟。
9) 使用含有0.1% Triton X-100的PBS轻轻冲洗细胞30秒。
10) 用PBST冲洗载玻片三次，每次30秒（室温）。
11) 每张载玻片上滴加200μl荧光二抗（稀释比例参考对应抗体说明书），在湿盒中室温孵育60分钟，尽量减少光照。
12) 用PBS冲洗载玻片三次，每次30秒（室温）。
13) （可选）每张载玻片上滴加200μl DAPI（稀释比例和孵育时间参考说明书），在湿盒中室温孵育20分钟，尽量减少光照。
14) （可选）用PBS冲洗载玻片三次，每次30秒（室温）。
15) 用纸巾轻轻擦去载玻片上的液体，然后倒置在载玻片上，滴一滴抗淬灭封片剂。
16) 静置20分钟晾干，然后用指甲油封住每一面，4°C避光可保存24小时。

请注意：使用此抗体（Anti-Pan Actin Mouse Monoclonal Antibody）进行Actin染色时，不建议采用多聚甲醛进行固定，建议使用甲醇或多聚甲醛/甲醇混合固定；而荧光鬼笔环肽染色时，应使用多聚甲醛作为固定剂，确保最佳效果。

二、活细胞中Actin的染色步骤

在活细胞中，肌动蛋白的结构可以通过加入荧光标记的肌动蛋白、表达GFP-actin或荧光标记的肌动蛋白结合蛋白亚域进行观察。荧光肌动蛋白是研究肌动蛋白结构的最佳工具，可以通过显微注射或蛋白质转染试剂引入细胞中。

1. 显微注射荧光肌动蛋白以染色活细胞中的Actin步骤（以Rhodamine肌动蛋白为例）

1) 用通用型肌动蛋白缓冲液将罗丹明肌动蛋白重悬至2mg/ml，并加入0.2mM ATP和1mM DTT，在冰上放置1小时以使肌动蛋白低聚物解聚。
2) 将罗丹明肌动蛋白溶液在14000×g下离心10分钟，收集上清液并通过毛细管装入显微注射针。
3) 将罗丹明肌动蛋白微量注射到细胞内，保持针内正压以防堵塞。
4) 在温控显微镜平台上使用低强度光和CCD摄像机观察细胞。

另外，尊龙凯时致力于提供高质量的生物医疗产品，包括SiR-Actin等先进成像探针。SiR-Actin是一种理想的活细胞成像探针，专为F-actin标记而设计，能够在活细胞中显著降低背景信号。

1. SiR-Actin活细胞成像探针使用方法

1) 制备SiR-Actin储备液：将小瓶中的SiR-actin溶解在50μl无水二甲基亚砜中，制成1mM的储备液，保存于-20℃。
2) 配置染色液：将SiR-actin在细胞培养基（如DMEM + 10%胎牛血清）中稀释至所需浓度，并短暂涡旋。
3) 准备细胞及染色：当细胞达到所需的密度后，用染色液替换培养基，确保所有细胞被覆盖，在37°C、5% CO2条件下培养，选择合适的标记时间和探针浓度。

以上步骤可帮助您高效地进行Actin染色，同时尊龙凯时始终致力于提供高品质的生物医疗产品，助力科研与医疗事业的发展，确保研究结果的准确性和可靠性。