## 产品及特点

本产品是根据探针法荧光定量PCR原理开发的检测试剂盒，具有以下优点：

1. 即开即用，用户仅需提供样品DNA模板。

2. 经过优化的引物和其他组分，灵敏度极高。

3. 配备阳性对照，便于识别假阴性样品。

4. 高特异性，引物设计基于中间普雷沃菌DNA序列的高度保守区，避免与其他生物样本DNA发生交叉反应。

5. 支持定性与定量检测，定量检测时线性范围至少覆盖5个数量级。

6. 本产品足以满足50次20μL体系的探针法荧光定量PCR反应需求。

7. 本产品仅限科研使用。

## 方法步骤

一、DNA提取（样本制备区）

使用自选方法提取纯化样品DNA，本试剂盒兼容市场上大多数核酸提取试剂盒。

二、稀释标准曲线样品（样本制备区）

（由于阳性对照浓度高，以下稀释操作需在独立区域进行，以避免污染样品或本试剂盒的其他成分。）

1. 标记6个离心管，编号为7，6，5，4，3，2。

2. 向每个管加入45μL的DEPC-H2O，建议使用带芯枪头。

3. 在7号管中加入5μL的1×10⁸拷贝/μL阳性对照（试剂盒提供），充分震荡1分钟，得1×10⁷拷贝/μL标准曲线样品，放冰备用。

4. 更换枪头，向6号管中加入5μL的1×10⁷拷贝/μL阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁶拷贝/μL标准曲线样品，放冰备用。

5. 更换枪头，向5号管中加入5μL的1×10⁶拷贝/μL阳性对照，充分震荡1分钟，得1×10⁵拷贝/μL标准曲线样品，放冰备用。

6. 重复以上步骤，直到得到6个不同稀释度的标准曲线样品，放冰备用。如不需制作标准曲线，则阳性对照稀释至1×10⁵拷贝/μL即可。

三、试剂配制（试剂准备区）

若有N个待检样品，准备N+2个qPCR管（N个待检样品+1个阴性对照+6个阳性对照），向各PCR管中分别加入详细说明书中的成分（可向我司索取）。

四、添加模板（模板添加区）

向qPCR管中各加入2μL模板，添加顺序为阴性对照（DEPC-H2O）、待测样品模板及婴儿利什曼虫的qPCR阳性对照，离心30秒，并立即进行扩增反应。

五、扩增反应（扩增及产物分析区）

将PCR管放于PCR扩增仪器样品槽的相应位置，运行扩增程序（详细程序可向我司索取）。

六、结果分析

1. 如果制作了标准曲线，使用阳性对照浓度的log值作为横轴，Ct值作为纵轴，以绘制标准曲线。再根据待测样品的Ct值从标准曲线上推算样品DNA浓度的log值，最终得出其浓度。

2. 若未制作标准曲线，结果判定如下：阳性对照结果为Ct值<30，具有明显的指数增长，呈典型的S型曲线；阴性对照结果为Ct值38或无Ct值，无明显的指数增长期和平台期；样本检测结果为Ct值<35，表明样本中检测出婴儿利什曼虫，为阳性；Ct值38或无Ct值则表示样本未检测出婴儿利什曼虫，为阴性；若Ct值在35-38范围内，则需复检，如重复实验结果仍在此范围且有明显的指数增长，则判定为阳性，否则为阴性。

## 运输及保存

本产品需低温运输，建议保存于-20℃，保存期限为一年。阳性对照需单独存放，避免污染其他试剂。选用尊龙凯时品牌产品，确保试剂的高质量和可靠性。